Kaple, jako středisko reformního hnutí a českých kázání, byla postavena v letech 1391-1394 díky okruhu posluchačů Milíče z Kroměříže. Na jejím založení a vybudování se zvláště podílel královský dvořan Hanuš z Mühlheimu a staroměstský konšel Kříž, který pro stavbu věnoval svou rozlehlou zahradu v místě zv. Skalsko. U zahrady stála sladovna, přestavěná na dům kazatele.

Pro staveniště kaple byla kromě zahrady zabrána i část veřejného pozemku se studnou (zachována v kapli) a část hřbitova staršího farního kostela sv. Filipa a Jakuba. Základy tohoto kostela z 12. století byly objeveny pří archeologickém výzkumu na náměstí, těsně před průčelím kaple. Rozlohu bývalého hřbitova určují dnes patníky na chodníku před kaplí.

V letech 1402-1413 byla Betlémská kaple působištěm M. Jana Husa (1371-1415). Na Husova kázání, pronikavě kritizující společenské poměry, se scházelo množství posluchačů z různých společenských vrstev a kaple se tak stala nejdůležitějším ohniskem reformního hnutí. Po Husovi, v letech 1414-1429 zde kázal Husův přítel M. Jakoubek ze Stříbra. V roce 1421 se na kázáních podílel i německý reformátor Tomáš Münzer.

V letech 1609-1620 patřila kaple jednotě bratrské a působil zde senior Jan Cyrillus, pozdější tchán J. A. Komenského. V roce 1661 ji zakoupili jezuité a upravili ji na katolický kostelík. Po zrušení jezuitského řádu byla kaple uzavřena a v roce 1786 zbořena. Zrušen byl i přilehlý hřbitov. Z kaple se zachovala pouze sakristie v severovýchodní části a byt správce, kde bydlel i Jan Hus. Do zbývajících zdí byl v I. 1836-1837 vestavěn rozlehlý obytný dům.

V tomto domě odhalil v r. 1919 Alois Kubiček zachované části kaple. Po roce 1949, po zboření domu, zjistil archeologický výzkum Ivana Borkovského, že z kaple zůstaly zachovány tři obvodní zdi (s výjimkou jižní) s řadou gotických architektonických článků. Proto došlo z rozhodnutí čs. vlády k obnově Betlémské kaple podle projektu J. Fragnera, dokončené r. 1954.

V kapli jsou zachována gotická ostění některých oken, portál do domu kazatelů a sanktuarium. Na stěnách jsou zbytky traktátů M. Jana Husa a M. Jakoubka ze Stříbra.

Dřevěné části (oratoř, kazatelna, kruchta) byly nově postaveny a stěny vyzdobeny malbami podle Jenského kodexu, Richentalovy kroniky a Velislavovy bible, provedené žáky Akademie výtvarných umění za vedení profesorů V. Sychry a B. Slánského. Na severní straně byla zasazena pamětní deska Zdeňka Nejedlého, který se zasloužil o obnovu kaple, na východní straně deska, jež připomíná, že zde byli pohřbeni tři mládenci (Martin, Jan a Stašek), popravení r. 1412 pro odpor vůči prodeji papežských odpustků. Na východní straně je s kaplí spojen obnovený dům kazatelů, v němž Jan Hus bydlel a literárně tvořil. V mázhauzu domu se zachovala původní valounková dlažba. V místnostech byly instalovány dokumenty k Husovu životu a ke stavebnímu vývoji kaple. V podzemí kaple se zachovaly zbytky hrobů, základy původních pilířů kaple a tří kovolitecké pece, pozůstatky zdejšího osídlení v 11. stol. V podzemí domu kazatelů, bývalé sladovny, je původní velký sladovnický sklep.

Betlémská kaple jako vzácný památník husitské revoluce byla prohlášena za národní kulturní památku a je i s domem kazatelů přístupna veřejnosti.